Optimization of Isolation and Culture Conditions of Wild Edible Fungus-Tricholoma albobrunneum

Lu Huan ^*　Wang Ruijuan ^*　Wan Jianing　Yang Hui　Xu Zhen　Shang Xiaodong　Liu Jianyu ^**

Institute of Edible Fungi, Shanghai Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization(South), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P. R. China; National Engineering Research Center of Edible Fungi; National R&D Center for Edible Fungi Processing; Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai, Shanghai 201403, China

* These authors contributed equally to this work

Corresponding author, xdshang@163.com; sxauljy@163.com

Abstract　A wild edible fungus fruiting body was collected from Ganzhou, Jiangxi Province and was isolated, identified by morphological and molecular characterization. The wild edible fungus was identified as Tricholoma albobrunneum of Tricholoma. Its ITS sequence submission to NCBI obtained GenBank number MT539126. Different medium formulations were used for isolation and purification of Tricholoma albobrunneum, and analyzed the effects of different carbon and nitrogen sources on the growth rate of Tricholoma albobrunneum. The results showed that the mycorrhizal soil extract was added to the medium 4, the mycelium growth rate was the fastest, the mycelium growth was strong, the pigment secretion was less. The best carbon source was brown sugar, the best nitrogen source was yeast extract, and the best medium combination was potato 200g, brown sugar 20g, yeast extract 5g, agar 20g, KH₂PO₄ 0.6g, MgSO₄ 0.6g, pH natural. It provided a basis for the later cultivation of Tricholoma albobrunneum.

Keywords　Tricholoma albobrunneum; Separation and purification; Carbon source; Nitrogen source; Growth rate

白棕口蘑，中文名又称白褐口蘑，学名：Tricholoma albobrunneum，分类地位属菌物界，担子菌门，伞菌目，伞菌亚纲，伞菌目，白蘑科(Tricholomaceae)，口蘑属(Tricholoma) (戴玉成等, 2010; 李传华等, 2013)。白棕口蘑是云南最常见的口蘑属种，它与松属(Pinus Linn)植物有关，在欧洲北部和中部相当罕见。在中国主要分布在云南, 西藏等地区，一般在秋天群生或单生于松树(Pine)等针叶林地上，也有生于针叶林和阔叶林交混的地上。白棕口蘑每年产量有限，但因其具有独特香气和顺滑口感，在产地非常受欢迎。

国内外目前主要针对口蘑有一定的研究报道，如孢子结构(Alfredo et al., 2020)；形态分析(田慧敏等, 2019, 湖北农业科学, 58(2): 137-142.); 王术荣等, 2020)；活性成分(Dominik et al., 2016; Feng et al., 2019)挥发性成分(Li et al., 2019)等，目前西欧对口蘑的物种多样性已进行了深入的研究(Kazuko et al., 2002; Feng et al., 2015; Gabija et al., 2016; Ivan et al., 2020)。然而对白棕口蘑却鲜有研究，仅有对白棕口蘑野生品种的分类及形态学特征的报道(Heilmann-Clausen et al., 2017; Kai et al., 2018)，无对其菌种纯化, 栽培驯化, 生物活性等相关性研究报道。因此，挖掘白棕口蘑种质资源对丰富扩建中国食用菌种质资源库，增加口蘑属多样性和分布知识具有重要意义。

本研究以在江西省赣州市上犹县梅水乡，海拔约500 m的丘陵北坡松树下采集到的野生菌子实体为对象，通过形态学和ITS技术鉴定为白棕口蘑，通过不同培养基配方对白棕口蘑进行分离纯化培养获得纯菌株，并设计分析不同碳源和氮源培养基对白棕口蘑菌丝生长的影响，同时对白棕口蘑菌株的生物学特性进行分析评价，为后续驯化栽培试验及品种开发利用提供一定基础。

1结果与分析

1.1形态特征

子实体中小型大小，菌盖直径3~7 cm，扁半球形至近平展，中部下凹，褐色，光滑，幼时边缘内卷，随成熟度的增加逐渐展平，分泌大量滑液。菌肉较薄，菌盖厚度0.4~1.5 cm。菌褶白色，延生，稠密，窄，不等长。菌柄较粗壮，长2.0~8 cm，粗1.0~2.3 cm，青白色，光滑，肉质，基部略膨大(图1)。孢子印为白色，孢子无色，光滑，椭圆形，(8~10) μm×(4~6) μm (图2)。符合口蘑的特征(黄年来等, 2010, 中国食药用菌学, 上海科学技术文献出版社, 中国, 上海, pp.886-887.; 李玉等, 2015, 中原农民出版社, 中国, 郑州, 1043-1052.)，将其初步鉴定为野生口蘑菌株。

1.2菌种的分离与纯化

1号培养基菌丝完全不生长萌发，4号培养基菌丝生长速度最快，菌落形态表现优良，无色素分泌，可能是添加了菌根泥土浸提液，有适合菌丝萌发的营养因子(表1)。因此，选择4号培养基进行后续纯化工作。转接5次后，菌落表型较为一致，边缘较为整齐，分泌深褐色色素量减少，得到纯菌种。

1.3 ITS鉴定

ITS序列PCR结果得到的琼脂糖凝胶电泳图扩增产物条带清晰，片段长度约为700 bp，符合测序要求，对样品进行双向测序。测序结果得到的序列在NCBI进行Blast比对(图3)。将所测序列结果提交至NCBI，生成GenBank编号为MT539126，Blast比对结果发现试验材料与口蘑属的白棕口蘑Tricholoma albobrunneum同源性最高，达到99.85%。结合形态学特征与分子鉴定结果，发现试验材料为白棕口蘑。用MEGA-X软件对供试材料与NCBI数据库中相关的ITS序列进行多序列比对，经最大似然法和最大简约法分析得出的系统发育树相似(图4; 图5)。由结果可知，此次收集的野生菌株序列与口蘑属的白棕口蘑序列在基于ITS序列构建的系统发育树上聚为一支，自举值(MLBS=96%, MPBS=97%)很高，支持在江西收集的野生菌株为白棕口蘑。

1.4不同碳源培养基对菌丝生长情况的影响

因在后续研究过程中，使用菌根泥土制作培养基容易受条件限制，需要筛选出适合野生口蘑生长的营养型培养基进行常规培养。因此，设计了不同碳源培养基，并观察野生口蘑在不同培养基中菌丝生长情况(表2)。由结果可知，野生口蘑菌丝生长速度和长势在10种不同碳源培养基上表现出差异性。在生长速度上，C1>C4>C3>C8>C10>C7>C6>C5>C2>C9，在P<0.05水平上，以添加红糖为碳源的培养基上野生口蘑菌丝生长最快，日均生长0.89 mm，添加木糖的培养基菌丝生长速度最慢，日均生长仅为0.44 mm，原因可能是红糖属于甘蔗加工副产品，经过加工提炼，更适合菌丝分解吸收，果糖和葡萄糖属于单糖，菌丝不容易吸收转化，故导致菌丝生长速度较慢。从菌落形态上来看，10个培养基上的菌丝生长都较为健壮，菌丝洁白，仅在浓密度上有差异，且与菌丝生长速度快慢成正比关系。综合菌丝生长速度和菌落形态结果，野生口蘑培养最佳碳源是红糖，说明野生口蘑对含有大分子营养物质，如非分蜜糖成分更容易吸收利用。

1.5不同氮源培养基对菌丝生长情况的影响

根据2.4.1最适碳源试验结果，以红糖作为碳源，设计10个氮源培养基，观察野生口蘑在不同氮源培养基中菌丝生长情况(表3; 图6)。由结果可知，野生口蘑菌丝生长速度和长势在10种不同氮源培养基上表现也有一定差异。在生长速度上，N10>N9>N6>N2>N7>N8>N5>N3>N4>N1，在P<0.05水平上，以添加酵母膏为氮源的培养基上野生口蘑菌丝生长最快，日均生长1.17 mm，添加尿素的菌丝生长速度最慢，日均生长仅为0.54 mm，原因可能是野生口蘑培养所需更为丰富的营养，以及酵母膏成弱酸性，说明野生口蘑适宜偏弱酸性条件下培养生长。从菌落形态上来看，10个培养基上的菌丝生长都较为紧凑健壮，菌丝洁白。综合菌丝生长速度和菌落形态结果，野生口蘑培养最佳氮源是酵母膏，说明野生口蘑更适宜添加营养丰富，且营养成分降解较完全的原材料条件下培养，后续还需要对野生口蘑进一步探索培养条件，增强菌丝活力。

2讨论

野生食用菌在食用菌资源中占有重要地位，且种类多样，营养价值高，全球范围内野生食用菌多达2 000多种，中国约有1 000多种，中国已成功驯化栽培的约100余种，商品化约60种(黄年来等, 2010, 中国食药用菌学, 上海科学技术文献出版社, 中国, 上海, pp.886-887.; 杨祝良, 2020)。中国食用菌种质资源丰富，但中国针对性地开展自主品种研究时间尚短，要想完成种质资源库的建立, 种质创制理论与技术的创新，推进国产品种的自主研发与推广工作，需不断进行野生种质资源的收集和评价。野生种质资源的收集和评价是中国食用菌产业发展的基础性研究，也是为丰富中国野生真菌资源提供基础保障。且食用菌都具有高蛋白质, 低脂肪, 富含维生素等特征(李杨等, 2021)，在现代健康饮食结构中占有重要比例，因此驯化营养价值高, 受市场喜爱的野生食用菌具有重要意义。

口蘑最初是作为Agaricus属的一个分支被Fries引入(Fries, 1821)，1857年Staude提出口蘑属单独作为一个属(Staude et al., 1857)。口蘑属现已有850多个菌株属于口蘑属，有些经现代技术鉴定为归属于其他属，例如广泛分布于东北和华北地区的蒙古口蘑(Tricholomamongolica S. Imai) (吴恩奇和图力古尔, 2007)，1937年今井三子将其归属于Tricholoma属(Imai, 1937)，2011年姚一建等建议将其从Tricholoma属划分出来，组建新属白丽蘑属(Leucocalocybe) (Yu et al., 2011)，2013年董冬和图力古尔(2013)通过分子手段验证蒙古口蘑与Tricholoma属区别。白棕口蘑在口蘑属中属于报道稀少品种，可能是由于产量较低，且不容易组织分离。据报道，1999年在法国普罗旺斯发现一株白棕口蘑，GenBank序列号为(MC99-060)；在希腊(UDB001218)和爱沙尼亚(UDB018044)也分别收集到白棕口蘑；2017年Heilmann-Clausen在法国分离鉴定出一株野生白棕口蘑(LT000077) (Heilmann-Clausen et al., 2017)；Horton在美国俄勒冈州发现一株野生白棕口蘑(AF458436) （unpublish）；2018年Kai等(2018)在云南采集分离到10株野生白棕口蘑(MB-003002, MB-003003, MB-003004, MB-003006, MB-003007, MB-301912, MB-305048, MB-305554, MB-305558和MB-305567)。

本研究发现的白棕口蘑生于松树林地上，呈散生或群生状态，该结果与王术荣等(2020)所报道新发现口蘑生长环境结果相同。基于ITS片段的系统发育分析显示该菌株与Tricholomaalbobrunneum MT808202在同一个分支，且具有显著的高支持率，支持该菌株为白棕口蘑。此外，ITS 序列分析显示此次发现的白棕口蘑与Heilmann-Clausen (2017)在法国和Horton在美国发现的白棕口蘑亲缘关系较远，可能是由于距离造成的物种遗传距离变化。本研究通过加菌根泥土浸提液的马铃薯琼脂培养基成功分离到无色素分泌的白棕口蘑纯菌种，同时通过添加不同碳源和氮源对白棕口蘑菌丝生长速度的影响，发现菌丝生长最佳碳源为红糖，最佳氮源为酵母膏，该结果与马紫英等(2015)研究的巨大口蘑最适碳氮源略有差异，可能是由于属于不同种属有关。

目前对白棕口蘑研究极少，关于白棕口蘑的营养成分, 菌株培养条件和生物学特性等都未有研究。白棕口蘑是中国云南地区分布较广的野生食用菌品种，本研究在江西松叶林地里发现鉴定出该品种，拓展了白棕口蘑品种的地理分布，丰富了白棕口蘑的种质资源。本研究还得到了白棕口蘑的纯菌株，为后期白棕口蘑的生物学特性开发和驯化栽培试验提供了理论基础。

3材料与方法

3.1试验材料

供试野生食用菌菌株经组织分离培养，保藏于中国农业微生物保藏中心食用菌分中心，保藏编号为5098。

3.2主要试剂与仪器

供试化学试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；红糖、白砂糖、麸皮、米糠、玉米粉和豆粉均为市售；分子生物学试剂(Thermo Fisher Scientific公司和天根生化科技有限公司)；分子鉴定引物ITS1、ITS4，上海生工生物工程技术服务有限公司完成分子测序。

恒温培养箱(LRH-250, 上海一恒科学仪器有限公司)，高压灭菌锅(TOMY SX-500, 日本TOMY公司), 数显鼓风干燥箱(GZX-9240, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，超净工作台(VS-1300L-U, 苏州安泰空气技术有限公司)等。

3.3菌种的采集，分离纯化

2020年2月25日，在江西省赣州市上犹县梅水乡海拔约500 ｍ的丘陵北坡松树下采集到野生食用菌，测定颜色, 大小和长度等农艺性状。对采集的野生样本在PDA上进行组织分离，取幼嫩健壮的子实体，首先用无菌水清洗，再用75%酒精对子实体表面进行消毒处理，用手术刀和镊子无菌操作取菌盖与菌柄交界部位的菌肉(1 cm大小)，接种于PDA固体培养基上，置于25 ℃培养箱中培养。分离菌块培养第3d后菌丝开始萌发，第5天在不同培养基(表4)上进行第1次转管培养，观察菌丝生长情况。以菌丝生长速度快，菌落形态表现优良的培养基为主要培养基，选取菌丝健壮, 生长较为一致的部位进行5次转接纯化，得到纯化菌种。

3.4 ITS序列测定及系统发育树构建

用接种针挑取少量菌丝放进100 μL TE buffer 混合，置于PCR仪，97 ℃加热5 min。取出混合液置于冰上，混合吹打至少20下。选用通用引物ITS1 (5'-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3')，PCR扩增ITS片段。PCR反应条件：20 μL反应体系，上述混合液模板1 μL，引物1 μL，Taq Mix液10 μL，补加去离子水至20 μL。PCR扩增程序为：预变性，94 ℃ 5 min；变性94 ℃ 30 s；退火57 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 1 min；共35个循环；延伸72 ℃ 10 min。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，经纯化和测序获得的序列经手工校对后，于GenBank进行比对和注册序列号。

3.5菌丝与孢子显微结构的观察

参照万佳宁等(2018)的方法进行菌丝和孢子的显微结构观察。

3.6不同培养基对菌丝生长速度及菌落形态的影响

设计了碳源培养10个(表5)，根据C/N比及最适碳源，设计氮源培养基10个(表5)。

3.7数据分析

将测序所得的ITS序列提交到 GenBank，并进行BLAST比对。采用MEGA-X软件对供试材料与NCBI数据库中相关的ITS序列进行比对，以最大似然法(maximum likelihood, ML)构建ML树，以最大简约法(maximum parsimony, MP)构建MP树，自举检验1 000次，分析检验各节点的置信度。所有测定的菌丝生长速度试验均进行5次平行重复，取平均值，采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。

作者贡献

陆欢和王瑞娟是本研究的执行人，共同完成了论文初稿的写作；万佳宁完成了菌丝和孢子染色拍照研究；杨慧和徐珍为本研究提供了试验材料的准备；刘建雨提供了试验设计建议；尚晓冬提出了试验想法，并为本研究提供了指导，及完成了文章的修改和定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市农业科学院卓越团队建设计划项目(ZY1601)资助。

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